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瓜類細菌性果斑病菌探針法熒光定量PCR試劑盒反應五要素

發(fā)表時間:2021-12-10
瓜類細菌性果斑病菌探針法熒光定量PCR試劑盒反應五要素:

參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:

①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。

②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量產(chǎn)生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

 斯氏李斯特氏菌
 側孢短芽孢桿菌
 乳酸乳球菌乳亞種
 牙齦卟啉單胞菌
 菩提奇異球菌
 干燥棒桿菌
 屎腸球菌(屎鏈球菌)
 具核梭桿菌多形亞種
 脆弱擬桿菌
 齒雙歧桿菌
 粘性放線菌
 植物乳桿菌植物亞種
 遲緩愛德華氏菌
 哈氏弧菌
 Hydrotalea flava
 萎縮芽孢桿菌
 血鏈球菌
 醋酸醋桿菌
 伊氏李斯特氏菌
 英諾克李斯特氏菌
 紅曲霉
 不動桿菌
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 多頭霉
 掘氏疫霉
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 大腸桿菌
 酸土脂環(huán)芽孢桿菌


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